Бабушке пришло оповещение, что ей пришла посылка. Кто, что, зачем - не понятно. А оказалось ей прислали сервиз от государства в честь юбилея. С гербами даже.
У ху! Ей сегодня 90 лет!!! (но это не точно) Почему не точно? Потому что когда после войны все выдавали паспорта вместо утерянных или не полученных, или еще что-то, очень многие базы данных были уничтожены, и бабушка рассказывает такой диалог: -Когда ты родилась? -Не помню.... 26... 28.. 29.. год.. наверно... -Ну пусть будет 28 год. А когда родилась? Летом? Зимой? -Весной, кажется. -В начале, середине, конце? -Кажется, где-то в середине. -Отлично, так и запишем: 15 апреля.
Качельки - приз за Мифы от PanteraLana. Вот, наконец, приз дошел до нас х)
Забрал я вот такую коробку-зомби. Ее зовут Дадли. Потому что в первом ГП Дадли описывался как тот, кто садится на стул, и обнимает сидение своим жиром. А мы на почте когда пытались взвесить, клали ее на весы, а коробка всеми углами встала на стол, обнимая собой весы. Но в общем, хоть она и вся порванная, с дырками насквозь, что не то, что рукой можно достать, но и само может выпасть, вес остался прежним. Хотя, конечно, вскрытие зомби сделали и на почте, проверить на всякий случай. Тем более там была бумага, которую мне надо было поднимать, что все пришло и я не имею притензий, все такое
У всех есть распоковочное животное. У меня это тупая псинка х) Коробка такая порванная не мной, это так было хд Зомби же.
Ну, в общем в коробке было "на донышке", поэтому она вся такая разломанная - она большая, на нее, очевидно, ставили сверху, а она почти пустая, вот и сломалась вся. Собирается на наитию элементарно, легче чем стул из Икеи х) Качельки двухцветные - каркас серый, а сиденье - львы, крылья - синенькие *_* я в восторге
Крис даже перестал на меня смотреть презрительно. То ли качелькам рад, то ли знает, что раз они приехали, то с него смоют мейк трансвистита и дадут отрастить бороду.... Мне кажется, нам немного высоковато... или это у нас ножки коротковаты... но это решает заменой цепи, так что вообще не проблема х)
Я доверчивый идиот. Надо мне в достика перетипироваться...
Ой... без лоха и жизнь плоха.
Я попался на самый простой развод. когда взламывают страницу в вк и пишут "одолжи". Короче я молодец, я одолжил ^^"
Был в полиции. Там поймали парня за вождение в нетрезвом виде. Сидел рядом. Захотел курить. пошел на улицу, его не выпустили. Вернул его полицейский с фразой "это ваш?", потом на мужика посмотрел и сказал "нехрен по территории шляться, тут сидите". Пошел он через некоторое время в туалет, нам начал курить, на него сразу все матом начали орать. В клетку пообещали посадить. Он еще поорался матом, потом уснул. Меня вызвали, я до этого просидел в ожидании около 2 часов наверно, потом около часа провел по составлению заявления, вышел - мужик все сидит ждет. хддд
причем я звонил когда им, и когда пришел у дежурного, спрашивал - мол, надо писать вообще, или это типо и вам морока, и мне морока, а выход нулевой. Все сказали "пишите, пишите". А тот кто уже работал со мной сказал, что по телефону не могу сказать - там прослушивают. А дежурные мол только записывают, и не разбираются х)))
Еще успокоил типо, что не я одна такая, и прямо передо мной была девушка, которая 200 с кредитной карты потеряла из-за мошенника. Но там смс с неизвестного телефона из серии "прошла операция на 20 тыщ, если вы этого не делали - позвоните", а когда звонишь просят все данные карты ._.
Честно украл у Властелин Ничего Увидела прикольное Хогвардс-бинго у Santa Evita *0* Репостишь себе, отмечаешь подходящие клеточки (например, стикерами), если собралась прямая линия - это твой факультет! Шаблоны тут: twitter.com/Gayffindorteam
Кажется, я отмечал противоположные иногда... но оно так и есть хддд Гамлет, хрен ли...
Хммм... крылья помещаются в машину (x-trail!!!) только если разложить сидение. А они итак уже разделены на 3 части. Кажется, уже можно не надеяться, что и мы, и стенды поедем на доллскар на одной машине, а не на разных х(((
Сижу, никого не трогаю, занимаюсь своими делами. Поднимаю голову, а там... вот... Он же ровно сидел,... почему он на меня так смотрит.... как тут не быть одушевителем, блин... Хотя.. я же с Тони занимался.. наверно заревновал... Или это он говорит делать стенд, а не фигней страдать..
Чтобы агробактерия (Agrobacterium tumefaciens - агробактериум тумефациенс) передала при трансформации растения последнему целевые гены, нужно чтобы эти гены были в бактерии (Л. Логика)
Как гены попадают в бактерию?
читать дальше Трансформация агробактерии ничем не отличается от трансформации Эшерихии коли (Escherichia coli).
А для трансформации Э.коли берется наработанный методом ПЦР целевой ген, вставляется в плазмиду, а потом плазмида - в бактерию. готово.
Вставка наработанного гена в плазмиду - очень простой процесс в наше время. Продается множество векторов (PAL2T, PTZ57), какой лучше не известно, есть очень условные критерии, но всегда лучше попробовать 1-2-3 разных. Один и тот же вектор может в одном случае сработать идеально, а в другом случае, отличающимся минимально, не сработать вообще.
У каждого продаваемого векторе есть "карта". Она выглядит так:
Красным здесь написаны сайты рестрикции - то есть то место, где тот или иной фермент (его название и написано красным), сможет разрезать "ножницами" данный вектор. Цифры рядом - это длина от "начала" плазмиды до места рестрикции.
У каждого вектора есть 2 селективных гена как минимум - устойчивости к антибиотикам чаще всего, что бы бактерия от него не избавилась. Какие именно гены в той или иной плазмиде можно узнать по их кодовым названия - в данном случае это bla (ApR) - устойчивость к ампициллину. Так же есть ген, ответственный за репликацию (удвоения) этой плазмиды - rep pMB1. Он так же обязан быть. Вторым селективным геном является ген LacZ - он помечен синеньким на карте. Он отвечает за окраску бактерий в синий цвет (если есть необходимый компонент в среде) Как видно, ген ЛакЗ разделен двумя зелеными участками - это "множественный сайт клонирования". Как видно, на этом участке гена ЛакЗ очень много сайтов рестриктаз. Именно между двумя зелеными участками вставляется целевой ген. И если ген вставился, то ген ЛакЗ получается разделенным, и теряет свою функцию - бактерии остаются белыми. А если встройка гена не произошла, и плазмида замкнулась сама на себе, то ген ЛакЗ работает, и бактерии окрашиваются в синий цвет.
Вот так это выглядит на чашке Петри
Процесс встройки гена в вектор называется Лигирование Для этого банально смешивается ПЦР-фрагмент, вектор, буффер для лигирования (так же продается), АТФ, и Т4-лигаза. И оставляется на столе на ночь. Готово.
Трансформация бактерий полученным вектором Клетки бактерий смешиваются со смесью после лигирования. Для контроля качества клеток, в другом эппендорфе эти же клетки - с контрольной плазмидой (например, GFP). Оставляют во льду, после чего опускают в горячую воду (хватает и 42") на полминуты. Что бы поры бактерии открылись и она поглотила в себя плазмиды из окружения После - снова в лед на пару минут - что бы поры резко закрылись и бактерия не успела "выплюнуть" плазмиды. После к бактериям добавляют немного питательной среды (они обычно растут на среде LB или YEB), и оставляют на час на 37 градусов. Бактерии успеют нарасти чуть чуть, плазмиды поделится. После чего выращивают ночь на чашке Петри. Чашка Петри содержит агаризованную (с добавлением агара) питательную среду, так же, обязательно, антибиотик, к которому устойчива бактерия, если она содержит вектор. Чашка со средой с антибиотиком может хранится около месяца, потом антибиотик разрушается. Без антибиотика - намного дольше. Хотя иногда бывает берешь чашку, хочешь на нее что-то посадить, а она тебе такая, пошел ты:
Тут на чашке вырос золотистый стафилокок. И хотя на остальной поверхности чашки ничего не видно, чашка нестерильна, среда не стерильна, и использовать ее для опытов нельзя.
Для того, что бы бактерия приобрела синий цвет на поверхность застывшей среды добавлюсь IPTG и X-GAL. Они не очень хороши для бактерий, поэтому важно не доабавить слишком много, и дождаться пока они высохнут. И только потом высаживать на чашку бактерии (Сажают просто переливая то, что было в эппендорфе после всех манипуляций, описанных выше)
По чашке петри вырастают колонии - т.е. сообщество клеток, прородителем которых была одна клетка. Если колоний много (На картинке выше каждая белая точка - колония), есть шанс, что какая либо точка это не одна, а две или три колонии, особенно если точки большие. Поэтому колонии пересаживают еще раз. Дно чашки петри разлиновывают (с внешней стороны), и зубочисткой пересаживают на новую чашку Петри, и оставляют рости ночь.
Чашки хранятся с ноября, и могут хранится долго. Главное - донышком вверх, что бы влага не испарялась
После это колонии наращивают в жидкой среде. Это можно делать в эппендорфах, фальконах или просто колбе.
Слева - с прозрачной средой - без бактерии. По середине с бактерией, справа - с контроль с синей бактерией
Если необходимо просто проверить правильность вставки - можно выращивать в эппиндорфах, если нужно, что бы бактерии остались живы для дальнейшей работы, то нужно больше воздуха - и тогда только в фальконах или колбочках
Для проверки вставка проводят лизис. Выращают в эппендорфах ночь. центрифуригуют, сливая все, оставляя лишь осадок в виде бактерий. Осадок ресуспензируют в лизис-буффере, который разрушает их. Для полного разрушения кипятят (в кипятке прям) минуту, и снова центрифугируют, что бы все, что осталось от бактерий упало на дно. Плазмиды, ДНК остаются в растворе. Который прогоняют на геле. ДНК и Плазмиды тоже разрушаются частично, поэтому метод годится только для ответа "да-нет", и ничего в дальнейшую работу идти не может
Колония, днк которой нанесено на 4-ую дорожку имеет вставку, остальные - не того размера (слишком маленькие)
Для более точного анализа другим более длинным и щедящим методом выделяют днк. После чего проводят рестрикционный анализ - к ДНК добавляют фермент, который разрезает плазмиды (и, желательно, не режет целевой ген), и наносят на гель. Зная, где должен порезать фермент, известны длины фрагмента(ов), который(ые) должен(ны) получится. Для точности повторяют с разными ферментами.
Когда в бактерию вставлено то, что нам нужно, она идет уже в дальнейшую работу. В аграбактерии вставляют другие конструкции, но суть та же. вектор - pCambia чаще всего.
С дачи привез все коробки, вкоторых разные сверла в перемешку лежат, и сейчас разобрать дошли руки... Я весь день разбираю по простой схеме - по металлу, по дереву (перья, спиральные, ложечковые, корончатые), по бетону, по стеклу, центровачные,.. развертки, зенкели, почему-то попавшие метчики и надфели, фрезы,... Они же все легко внешне отличаются друг от друга... что ж я так заебался то?! ладно бы по размеру разделял.. а то по виду...
Сегодня был на выставка-продажа Рептилиум. Не жил бы с мамой, давно бы купил себе змею. Кажется, я обтискал всех змей на выставке, каких только смог. Боже, они прекрасны. Я специально даже кошелек дома оставил, что бы не решить "да пошли вы" и не купить одного из них. Хотя там была одна змейка, я в нее просто влюбился, мне даже предложили ее "отложить", что бы я забрал ее на неделе, позже. Аааарх....
Но нет. Как там было в "Охотниках"? -Можно увеличить мощность? -Можно,.. но не сейчас.
А продаются они еще там смешно - маленькие продаются в баночках, в каких продается "деревенская сметана", большие в таких же, но побольше. Но самое забавное было, что на одном из столов продавали их в коробках из-под суши хддд Народу была тьма. Можно было увидеть только столы с терририумами и домиками. Остальные столы - даже с кормом типа сверчков, тараканов и мышей - были забиты посетителями. Избавится от мысли "наверно так же себя чувствуют люди с мороза на доллскаре" никак не мог. Более того - я видел эти самые выражения лица вокруг людей, которые вроде пришли смотреть на понятное всем, а на деле это такая непонятная хрень хдддд
А пока я купил себе маринованную змейку. да, вот такой я странный, не могу купить живую, купил мертвую
Издавно человек культивирует растения. По началу простым отбором, после создал методы селекции. А сейчас появились методы генной инженерии.
читать дальше Культурные растения и домашние животные появились довольно просто - человек сохранял для воссоздания потомста те организмы, которые ему больше всего нравятся. Говоря о растениях - это те, которые дают больше всего урожая. Самые большие клубни картофеля, самые большие зерна, или зерна с растений, где больше всего зернышек сажались на будущий год. Это - самый простой метод традиционной селекции. И самый долгий. Так растения растут выше-больше, но все другие критерии растения, не так необходимые человеку, терялись, в частности устойчивость к засухе, к засолению, к различным грибкам. Растения начинали больше болеть и гибнуть.
Что бы восстановить устойчивость растений человек скрещивал растения с ближайшим диким видом, устойчивыми культурными сортами, или - самое сложное - с далекими видами. метод гибридизации Гибриды часто теряли вкусовые и урожайные качества, но приобретали устойчивость. Или и теряли все нужное, и не приобретали желаемого. Метод до сих пор широко используется.
За последние сто лет появились и другие методы традиционной селекции, против который никто не возражает, это же не ГМО.
Самый простой из них - это мутагенез. Когда растения обрабатывают какими-либо мутагенными факторами. Это могут быть химические вещества, или разного вида излучения. В результате чего в растениях могут быть генные, хромосомные и геномные мутации. Мутации, в общем, могут быть 3 разных типов - когда "что-то" вставляется, когда "что-то" перемещается в другое место, или когда "что-то" исчезает. В генных мутациях это может быть влезший в последовательность гена лишний нуклеотид, сместивший рамку считывания, кусок гена может вырезаться и влезть в другой участок этого же гена, или в другой ген. Ну, или вырезаться и все. В хромосомный - то же самое, но на уровне хромосомы - кусок, например, целое плечо хромосомы может просто исчезнуть. В геномных мутациях речь идет о количестве хромосом - может быть 1 лишняя, или наоборот, исчезнуть ит.д.
Какие это будут мутации, где они будут, сколько их будет - неизвестно. Совершенно. Более того - генные мутации очень сложно поймать в таком случае. И если растение выросло с большим урожаем и устойчивое к грибкам, считается хорошим. А то, что изменения могут привести к ядовитости мало кого волновало по началу, хотя сейчас все такие растения проходят испытания на мышах.
Что такое ГМО? Какие методы? Для чего? Я рассмотрю три самых популярных метода.
Метод ГМО, который дорогой, редко используемый и в основном для растений, которые плохо (или совсем не) восприимчивы к другим методам, но который любят показывать телевизионщики - это бомбордировка. А слово-то какое страшное. А как происхожит жутко, ууу! Берутся микро-частицы золота или платины, на них прикрепляются последовательности ДНК, и этими частичками золота бомбардируются растения, где последовательности ДНК случайно встраиваются в геном клетки. Звучит страшно, но Саузерн-блотинг анализом можно узнать сколько было вставок, и где, потому что - в отличие от мутагенеза - структуру ДНК нарушает известная последовательность. Этот метод в основном используется для "выключения" генов. Т.е. если в последовательность гена встраивается кусок, ген кодирует совершенно другой белок и со своей изначальной функцией не справляются. Это используется, что бы узнать, какой ген за что именно отвечает. А так же для различных опытов. Двойными мутантами называются растения, у которых выключено два гена.
Так же есть метод электропорации. Клетки растений имеют мембрану и клеточную стенку. Протопластом называется клетка без клеточной стенки, только с мембраной. В мембране есть поры, через которые в нормальном состоянии чужеродные ДНК не попадают. Протопласты помешают в солевую ванночку и пускают небольшой ток. Поры клетки стоновяться больше (при большом токе клетку вовсе разорвет). Для бактерий так же используют тепловой шок - на несколько секунд помещают в горячую воду. ДНК попадает в клетку через раскрытые поры, так же клетка сама хватает ДНК и после снятия шокового воздействия - "а вдруг поможет".
Обоими этими методами длинные цепочки - например ген целиком - крайне сложно загнать в клетку.
Существует третий, самый распространенный метод генной инженерии. В природе существует агробактерия (агро - земля. Это бактерии в природе живущие в почве). Она через ранки на деревьях проникает в них, и заражает клетки деревьев, отчего те начинают синтезировать (производить) не то, что нужно им, а то, что нужно бактерии. На деревьях образуются большие опухоли, в которых комфортно живут бактерии. Как происходит. У бактерий ДНК - кольцевая. Так же есть множество небольших допольнительных ДНК - называются плазмиды. Плазмидная ДНК. Прижимаясь к растительной клетке бактерия прокалывает ее клеточную стенку и мембрану, и передает в нее часть плазмиды. Этот кусочек ДНК встраивается в хромосому, благодаря повторам на концах. Кусочек ДНК и кодирует необходимый для бактерии ген. Обычно она передает клетке несколько копий этого гена, что бы клетка его больше нарабатывала. Это происходит в природе уже веками. Так же бактериям свойственно поглощать ДНК из среды вокруг - вдруг пригодится. А если не нужно - избавляется от него. И происходит так, что бактерия берет ген у одного растения, через горизонтальный перенос передает другим бактериям, и какая-то другая бактерия, вместе с геном, что бы была нужная опухоль, отдает растению ген другого растения. Вот вам и береза с геном от одуванчика. Просто ген одуванчика только в опухоли на березе, но все равно. И это делает природа, повторюсь, веками.
Что делает человек? Человек просто вырезает ген бактерии, и вместо него вставляет ген интереса (целевой ген). И бактерия уже заражает клетки растений не геном, нужным бактерии - его уже нет, а геном, необходимым человеку. Метод, по сравнению со всеми вышеописанными самый деликатный, самый точный. Ты точно знаешь что ты вставляешь. Ты легко можешь проверить куда и в каком количестве.
Растения, так же, как и бактерии, могут избавляться от ненужных им генов. А гены, которые вставляет человек часто "не нужны" растению. И что бы растение не избавилось от него, вместе с целевым геном вставляют ген устойчивости (обычно - к антибиотику). После чего сажают растения на антибиотики. Кто выжил - тот трансформант. Используют так же не ген устойчивости, а ген, по которому можно внешне отличить трансформированное растение от не трансформированного - например ген, что бы растение светилось в темноте. Нецелевые гены, помогающие отобраться трансформанты называются маркерными генами, или генами селекции (селекционные гены).
Самое интересное по телевизору.
ГМО плохо. ГМО запрещено. ГМО это страшно и жутко вредно. Но по телевизору можно услышать о хороших растениях, полученных методом, изобретенным самой природой. Когда агробактерия, взятая из почвы, помогает селекционерам развить в растении нужные качества. Матушка природа делает так давно, и это безопастно. Так же по телевизору вы не услышите о трансгенных растениях, Это же ГМО, это плохо! Вместо этого используются специальная маркерная селекция - когда растения специально помечаются, и селекционерам легче отобрать. Это обычная селекция, просто маркерная. Ну... ну вы поняли...
Немного картинок из моего диплома Электрофореграмма результатов ПЦР-анализа В дипломе мы трансформировали несколько линий картофеля геном устойчивости к фитофторозу - это целевой ген. Маркерным геном был ген GFP (green fluorescent protein) - ген флуорисценции, выделенный из медузы, и используемый оооооооочень часто в "маркерных растениях", создаваемые методом изобретенным самой природой х) ПЦР-анализ. Выделяемая ДНК из растений содержит некоторое количество копий нужного гена. Что бы определить его наличие искуственно заставляют полимеразы синтезировать только этот ген. Полимераза - это фермент, удвояющий ДНК. Что бы начать делать свою работу, ей нужно "куда-то" сесть. В клетке есть специальные "затравки". В пробирке используются праймеры. Для определения наличия какого-либо гена используется 15-20 нуклеотидов с одного и с другого конца гена. Полимераза садится на праймер и делает ген. Его становится больше, больше, больше. Если праймеру некуда сесть (нет целевого гена в пробирке), реакция не идет. После реакции получившуюся смесь разделяют в агарозном геле просто поместив этот гель в солевой раствор под напряжением. Более короткие кусочки "убегают" дальше от лунки, в которую была залита проба - им легче проникать между молекулами геля. Более длинные - "убегают" короче. На рисунке "М" - это маркер. Смесь последовательностей известных длинн, с помощью которого можно примерно оценить длину соседних фрагментов. "С-" - отрицательный контроль, для которого используется растение "дикий тип". (Дикий тип - это изначальное, нетрансформированное растение. Любое, как культурное, так и нет. Дикий вид - "некультурное" растение) "С+" - положительный контроль, для которого используется плазмида. Для ПЦР анализа использовались уже отобранные по селективному гену растения, и проверялись на наличие целевого гена. В данном случае у всех растений есть "полоса" нужного размера - значит все имеют встройку гена.
Электрофореграмма результатов Нозерн-гибридизации Встройка гена не всегда означает его транскрипцию. Возможно, что ген есть, но молчит (молчащих генов в любом организме много, это может быть по многим причинам). Поэтому необходимо проверить его экспрессию. Для этого выделяют из растений РНК и прогоняют на агарозном геле - левая часть картинки. После чего к гелю прикладывают мембрану, на мембрану кладут бумажки, а низ геля помещают в раствор, и благодаря силам, которые поднимают воду вверх, смачивая бумаги на мембране РНК переносится с геля на мембрану, которая задерживает ее в себе, не давая уйти на бумажки. После этого радиактивной меткой, которая садится только на РНК целевого гена обрабатывают мембраны, и в итоге получается картинка как справа. Если есть пятно - значит целевой ген экспресируется. В данном случае это справедливо для всех растений. Можно по яркости пятен сравнить где гена экспресируется больше, в где меньше. Но очень приблизительно. (Для оценки количества экспресии генов используется метод ПЦР в реальном времени)
Экстракт пептидов Когда трансгенные растения выросли, они должны были наработать пептиды, которые помогают им защищаться от фитофтороза и альтернариоза (Самые растространенные грибки, поражающие картофель) На первой картинке - листья картофеля, растертые в жидком азоте и залитые экстрагирующей смесью. На второй картинке - получившаяся и уже растаявшая смесь, но отцентрифузированная. На третьей картинке виден белый осадок - это и есть экстракт пептидов.
фитофтороз На картинках видно, как зооспоры выходят из зооспорангия (слева), и виден уже развитий мицелий гриба фитофтороза (черные полосы)
Влияние экстрагированного комплекса пептидов на зооспорангии фитофтороза Как видно, зооспорангии не открывается, и зооспорыне выходят. Заражения грибом не может произойти.
Ну и в последующий опытах было показано, что трансгенные линии лучше дикого типа устойчивы к фитофторозу.
Интересно, будет ли хоть один стенд хоть на одну выставку, не политый моей кровью? И ведь все так хорошо шло, что я думал, что кровь пустят змеи. Но нет, львы оказались проворнее. х)
подарите мне кто-нибудь металлическую перчатку-кольчужку, а то я точно без пальцев останусь хддд
Кажется, это начало конца. Кукольная обувь и одежда перестала помещаться в двух больших коробках... И я уже думаю о комодике для всех их вещей... ==" Ну хоть на одной полке еще помещаются.... хд хотя они и расставлены постоянно по всей комнате или вообще у Иллиор