Логин
Чтобы агробактерия (Agrobacterium tumefaciens - агробактериум тумефациенс) передала при трансформации растения последнему целевые гены, нужно чтобы эти гены были в бактерии (Л. Логика)
Как гены попадают в бактерию?
читать дальше

Трансформация агробактерии ничем не отличается от трансформации Эшерихии коли (Escherichia coli).
А для трансформации Э.коли берется наработанный методом ПЦР целевой ген, вставляется в плазмиду, а потом плазмида - в бактерию. готово.
Вставка наработанного гена в плазмиду - очень простой процесс в наше время. Продается множество векторов (PAL2T, PTZ57), какой лучше не известно, есть очень условные критерии, но всегда лучше попробовать 1-2-3 разных. Один и тот же вектор может в одном случае сработать идеально, а в другом случае, отличающимся минимально, не сработать вообще.
У каждого продаваемого векторе есть "карта". Она выглядит так:

Красным здесь написаны сайты рестрикции - то есть то место, где тот или иной фермент (его название и написано красным), сможет разрезать "ножницами" данный вектор. Цифры рядом - это длина от "начала" плазмиды до места рестрикции.
У каждого вектора есть 2 селективных гена как минимум - устойчивости к антибиотикам чаще всего, что бы бактерия от него не избавилась. Какие именно гены в той или иной плазмиде можно узнать по их кодовым названия - в данном случае это bla (ApR) - устойчивость к ампициллину. Так же есть ген, ответственный за репликацию (удвоения) этой плазмиды - rep pMB1. Он так же обязан быть.
Вторым селективным геном является ген LacZ - он помечен синеньким на карте. Он отвечает за окраску бактерий в синий цвет (если есть необходимый компонент в среде)
Как видно, ген ЛакЗ разделен двумя зелеными участками - это "множественный сайт клонирования". Как видно, на этом участке гена ЛакЗ очень много сайтов рестриктаз. Именно между двумя зелеными участками вставляется целевой ген. И если ген вставился, то ген ЛакЗ получается разделенным, и теряет свою функцию - бактерии остаются белыми. А если встройка гена не произошла, и плазмида замкнулась сама на себе, то ген ЛакЗ работает, и бактерии окрашиваются в синий цвет.
Вот так это выглядит на чашке Петри

Процесс встройки гена в вектор называется Лигирование
Для этого банально смешивается ПЦР-фрагмент, вектор, буффер для лигирования (так же продается), АТФ, и Т4-лигаза.
И оставляется на столе на ночь.
Готово.
Трансформация бактерий полученным вектором
Клетки бактерий смешиваются со смесью после лигирования. Для контроля качества клеток, в другом эппендорфе эти же клетки - с контрольной плазмидой (например, GFP).
Оставляют во льду, после чего опускают в горячую воду (хватает и 42") на полминуты. Что бы поры бактерии открылись и она поглотила в себя плазмиды из окружения
После - снова в лед на пару минут - что бы поры резко закрылись и бактерия не успела "выплюнуть" плазмиды.
После к бактериям добавляют немного питательной среды (они обычно растут на среде LB или YEB), и оставляют на час на 37 градусов. Бактерии успеют нарасти чуть чуть, плазмиды поделится.
После чего выращивают ночь на чашке Петри.
Чашка Петри содержит агаризованную (с добавлением агара) питательную среду, так же, обязательно, антибиотик, к которому устойчива бактерия, если она содержит вектор. Чашка со средой с антибиотиком может хранится около месяца, потом антибиотик разрушается. Без антибиотика - намного дольше. Хотя иногда бывает берешь чашку, хочешь на нее что-то посадить, а она тебе такая, пошел ты:
Для того, что бы бактерия приобрела синий цвет на поверхность застывшей среды добавлюсь IPTG и X-GAL. Они не очень хороши для бактерий, поэтому важно не доабавить слишком много, и дождаться пока они высохнут. И только потом высаживать на чашку бактерии (Сажают просто переливая то, что было в эппендорфе после всех манипуляций, описанных выше)
По чашке петри вырастают колонии - т.е. сообщество клеток, прородителем которых была одна клетка. Если колоний много (На картинке выше каждая белая точка - колония), есть шанс, что какая либо точка это не одна, а две или три колонии, особенно если точки большие. Поэтому колонии пересаживают еще раз. Дно чашки петри разлиновывают (с внешней стороны), и зубочисткой пересаживают на новую чашку Петри, и оставляют рости ночь.
После это колонии наращивают в жидкой среде. Это можно делать в эппендорфах, фальконах или просто колбе.
Для проверки вставка проводят лизис.
Выращают в эппендорфах ночь. центрифуригуют, сливая все, оставляя лишь осадок в виде бактерий. Осадок ресуспензируют в лизис-буффере, который разрушает их. Для полного разрушения кипятят (в кипятке прям) минуту, и снова центрифугируют, что бы все, что осталось от бактерий упало на дно. Плазмиды, ДНК остаются в растворе. Который прогоняют на геле. ДНК и Плазмиды тоже разрушаются частично, поэтому метод годится только для ответа "да-нет", и ничего в дальнейшую работу идти не может
Для более точного анализа другим более длинным и щедящим методом выделяют днк.
После чего проводят рестрикционный анализ - к ДНК добавляют фермент, который разрезает плазмиды (и, желательно, не режет целевой ген), и наносят на гель. Зная, где должен порезать фермент, известны длины фрагмента(ов), который(ые) должен(ны) получится. Для точности повторяют с разными ферментами.

Когда в бактерию вставлено то, что нам нужно, она идет уже в дальнейшую работу.
В аграбактерии вставляют другие конструкции, но суть та же. вектор - pCambia чаще всего.
Как гены попадают в бактерию?
читать дальше

Трансформация агробактерии ничем не отличается от трансформации Эшерихии коли (Escherichia coli).
А для трансформации Э.коли берется наработанный методом ПЦР целевой ген, вставляется в плазмиду, а потом плазмида - в бактерию. готово.
Вставка наработанного гена в плазмиду - очень простой процесс в наше время. Продается множество векторов (PAL2T, PTZ57), какой лучше не известно, есть очень условные критерии, но всегда лучше попробовать 1-2-3 разных. Один и тот же вектор может в одном случае сработать идеально, а в другом случае, отличающимся минимально, не сработать вообще.
У каждого продаваемого векторе есть "карта". Она выглядит так:

Красным здесь написаны сайты рестрикции - то есть то место, где тот или иной фермент (его название и написано красным), сможет разрезать "ножницами" данный вектор. Цифры рядом - это длина от "начала" плазмиды до места рестрикции.
У каждого вектора есть 2 селективных гена как минимум - устойчивости к антибиотикам чаще всего, что бы бактерия от него не избавилась. Какие именно гены в той или иной плазмиде можно узнать по их кодовым названия - в данном случае это bla (ApR) - устойчивость к ампициллину. Так же есть ген, ответственный за репликацию (удвоения) этой плазмиды - rep pMB1. Он так же обязан быть.
Вторым селективным геном является ген LacZ - он помечен синеньким на карте. Он отвечает за окраску бактерий в синий цвет (если есть необходимый компонент в среде)
Как видно, ген ЛакЗ разделен двумя зелеными участками - это "множественный сайт клонирования". Как видно, на этом участке гена ЛакЗ очень много сайтов рестриктаз. Именно между двумя зелеными участками вставляется целевой ген. И если ген вставился, то ген ЛакЗ получается разделенным, и теряет свою функцию - бактерии остаются белыми. А если встройка гена не произошла, и плазмида замкнулась сама на себе, то ген ЛакЗ работает, и бактерии окрашиваются в синий цвет.
Вот так это выглядит на чашке Петри

Процесс встройки гена в вектор называется Лигирование
Для этого банально смешивается ПЦР-фрагмент, вектор, буффер для лигирования (так же продается), АТФ, и Т4-лигаза.
И оставляется на столе на ночь.
Готово.
Трансформация бактерий полученным вектором
Клетки бактерий смешиваются со смесью после лигирования. Для контроля качества клеток, в другом эппендорфе эти же клетки - с контрольной плазмидой (например, GFP).
Оставляют во льду, после чего опускают в горячую воду (хватает и 42") на полминуты. Что бы поры бактерии открылись и она поглотила в себя плазмиды из окружения
После - снова в лед на пару минут - что бы поры резко закрылись и бактерия не успела "выплюнуть" плазмиды.
После к бактериям добавляют немного питательной среды (они обычно растут на среде LB или YEB), и оставляют на час на 37 градусов. Бактерии успеют нарасти чуть чуть, плазмиды поделится.
После чего выращивают ночь на чашке Петри.
Чашка Петри содержит агаризованную (с добавлением агара) питательную среду, так же, обязательно, антибиотик, к которому устойчива бактерия, если она содержит вектор. Чашка со средой с антибиотиком может хранится около месяца, потом антибиотик разрушается. Без антибиотика - намного дольше. Хотя иногда бывает берешь чашку, хочешь на нее что-то посадить, а она тебе такая, пошел ты:
![]() | Тут на чашке вырос золотистый стафилокок. И хотя на остальной поверхности чашки ничего не видно, чашка нестерильна, среда не стерильна, и использовать ее для опытов нельзя. |
Для того, что бы бактерия приобрела синий цвет на поверхность застывшей среды добавлюсь IPTG и X-GAL. Они не очень хороши для бактерий, поэтому важно не доабавить слишком много, и дождаться пока они высохнут. И только потом высаживать на чашку бактерии (Сажают просто переливая то, что было в эппендорфе после всех манипуляций, описанных выше)
По чашке петри вырастают колонии - т.е. сообщество клеток, прородителем которых была одна клетка. Если колоний много (На картинке выше каждая белая точка - колония), есть шанс, что какая либо точка это не одна, а две или три колонии, особенно если точки большие. Поэтому колонии пересаживают еще раз. Дно чашки петри разлиновывают (с внешней стороны), и зубочисткой пересаживают на новую чашку Петри, и оставляют рости ночь.
![]() | Чашки хранятся с ноября, и могут хранится долго. Главное - донышком вверх, что бы влага не испарялась |
После это колонии наращивают в жидкой среде. Это можно делать в эппендорфах, фальконах или просто колбе.
![]() | Слева - с прозрачной средой - без бактерии. По середине с бактерией, справа - с контроль с синей бактерией |
![]() | Если необходимо просто проверить правильность вставки - можно выращивать в эппиндорфах, если нужно, что бы бактерии остались живы для дальнейшей работы, то нужно больше воздуха - и тогда только в фальконах или колбочках |
Для проверки вставка проводят лизис.
Выращают в эппендорфах ночь. центрифуригуют, сливая все, оставляя лишь осадок в виде бактерий. Осадок ресуспензируют в лизис-буффере, который разрушает их. Для полного разрушения кипятят (в кипятке прям) минуту, и снова центрифугируют, что бы все, что осталось от бактерий упало на дно. Плазмиды, ДНК остаются в растворе. Который прогоняют на геле. ДНК и Плазмиды тоже разрушаются частично, поэтому метод годится только для ответа "да-нет", и ничего в дальнейшую работу идти не может
![]() | Колония, днк которой нанесено на 4-ую дорожку имеет вставку, остальные - не того размера (слишком маленькие) |
Для более точного анализа другим более длинным и щедящим методом выделяют днк.
После чего проводят рестрикционный анализ - к ДНК добавляют фермент, который разрезает плазмиды (и, желательно, не режет целевой ген), и наносят на гель. Зная, где должен порезать фермент, известны длины фрагмента(ов), который(ые) должен(ны) получится. Для точности повторяют с разными ферментами.

Когда в бактерию вставлено то, что нам нужно, она идет уже в дальнейшую работу.
В аграбактерии вставляют другие конструкции, но суть та же. вектор - pCambia чаще всего.
@темы: Работа
читать дальше
но хотя бы ему будет больно :3
оу, это так миииило^^
Ну,... ну... все бы тебе, что бы синяки, ссадины и боль хдддд
Надеюсь, он в таком случае будет относится к ней так же, как когда был альбиносом в ДаВинчи х)))
Манхетен.. да... забавный персонаж.. х)))
хорошо бы)) ему бы пошло)
Ну тогда тебе понравится война бесконечности, судя по трейлеру там умирает насмерть 5 главных персонажей как минимум
Это не смешение вселенных, это изначально задуманный план. Намеки или фразы вскольз есть во всех фильмах о другом х))))
да, да, я ебанутый фанат марвел, который даже знает все вещи в особняке Стрэнджане знал) тогда ок, канон это святое))
То есть тебя не смущало, что чуть ни с первого фильма Марвел в разных фильмах появляются камни, которые везде называются "камнями бесконечности"? Что в Мстителях, что в Торе, что в Стрендж, что в Стражах? Что одни и теже люди, даже если не появляются сами, то упоминаются отсылкой?
В людях икс, например, даже не упоминается ни о камнях, ни о Старке, ни о чем.
Как и в деад пуле, хотя есть "мутанты" и школа, не упоминается о Ксавье.
А в мстителях+- и Стражах друг о друге упоминается. И открыто - не как "Ртуть" - один и тот же в разных фильмах, из-за того что права разные - называется Пьетро и Питер?)))
Кстати. Повод полюбить наших прокатчиков:
В Америке, в оригинале, когда вводили Ванду и Ртуть запретили их называть мутантами. Потому что права на мутантов у другой компании. А в русском дубляже они все равно мутанты х))))
Я какой-то очень тупой зритель, потому что не видел ни одной отсылки к другим фильмам, видимо, мне надо ткнуть, как сделал Дэдпул)))
То есть, где-то в районе трейлера Войны Бесконечности я вроде часть отсылок собрал, но все равно мне как не тру фанату все это видится несколько... приятнутым)
Может, наши прокатчики просто соломку стелют?) Вроде же были планы на смешивание Мстителей и Ко с Людьми Икс?)
А вообще пока не показан только один камень бесконечности. Остальные показаны.
Тессеракт.
Палка Локи - он же камень во лбу Вижна
Глаз Агамото
Эфир - жидкость из Тор-2
"шарик" из Стражей галактике, который планеты уничтожает и за который схватился Звездный Лорд. (кстати Сиф в сцене после титров отдавала хранить эриф колеекционеру. И именно ему же Звездный Лорд пытался отдать шарик хд))) ПС. Коллекционер - брат Грандмастера. И грандмастер этот из Тор-рагнарека который появлялся в Стражах Галактики х))
на смешивание Мстителей и Ко с Людьми Икс?)
не на момент "эры альтрона"
Но! Спасибо за разъяснения, потому что из-за протяженности серии во времени я уже слабо помню, что было в первых фильмах)
Насчет Чужого против Хищника - ок, сама идея в целом мне нравится, там именно два фильма как-то безобоснуйно прошли.
И я теперь не понимаю, ждать Хищников в новых фильмах про Чужого, или это был фанфик такой, и дальше все будет про больших человекоподобных существ.
Не сложнее, просто надо не раз и все вывалить хддд
А когда ты еще все комиксы знаешь, это вообще полный ад для тебя. Потому что ты знаешь, как это было, а тут тебе показывают совсем другую историю, и как-то... вот.. вот как-то.. ну...
Конечно потом уже понимаешь, почему они так сделали, потому что иначе в киновселенную это не легко был...
(Но зачем снимали фильм Железного члоевка с Экстримисом, учитывая что потом полностью забили на _все_ его события...)
А я после Завета вообще нихрена не понимаю.
Как-то после Чужой против хищника я понимал, (А что, два? Я один смотрел, где баба в щитом из головы Чужого бегала), как зачем-почему про чужих.
А после Завета вообще не понял почему чужие, что происходит, или это вообще к самым сужим не имеет отношения, тогда почему похожи...
(угу, баба со щитом - это первый, и он клевый, а второй - это где чужие начали жрать город, а потом на них сбросили атомную бомбу))
Тут как посмотреть: каждая вариация выглядит по-своему логичной. а) хищники нашли/вывели чудиков и используют их для охоты или инициации (события ХпЧ1) и б) большие белые люди на бубликах вывели Чужих, чтобы выпилить человечество или другую расу(Завет и Ко). Но вот между собой это стыкуется настолько хреново, что я очень надеюсь на какой-то обоснуй. Вопросов ко вселенной туча.
Ну... как сказать...учитывая сколько было перезапусков комиксов "канона" нет. любон действие фильма - это смешание нескольких комиксов.
Но глобально есть 2-3-4 вещи, которых не было, или они были совсем иные в любом комиксе
большие белые люди на бубликах вывели Чужих,
Да,.. но эти чужие совсем другие нежели в "оригинальных" чужих с Рипли
нене, такие же) другие (белые) были выведены сумасшедшим андроидом из, собственно, чужих и белых больших людей.
Там было как: в Прометее они полетели на планету, которая была указана в древних текстах, заразизись (дебилы), подохли (закономерно), а главгероиня и андроид улетели на планету, откуда прилетели большие белые люди.
Дальше в Завете герои летели жить в новый мир, а нашли Дэвида, который вывел новую породу чужих, и пытался с ними подружиться чтоль. А каноничный чужой из Рипли там тоже был, когда один из прилетевших спустился в подвал.
что канон и правда пляшет)
белыми нитками все каноны комиксов сшиты Стрэнджем, и намного более нежно и мягко с помозью Локи
прометея я смотрел вчера, завет вот в планах на сегодня вечер.. Эх, Эрик... только ради него смотрел прометея с его школой убегания от предметов по прямой...
просто там, в прометее, же был монстро-щупальце, заражение человека от слизи, а не от крабика...
Но таки чужой, самый настоящий, черный, там тоже был) а в роли фейсхаггера - одноглазая, я извиняюсь, змея, которую один из дебилов потрогал в подземелье, а она ему в ответ руку сломала) Видимо, все объясняется некими супер-мутациями, горизонтальной передачей генов-и-всего-чего-только-можно, и вообще ойвсе.
Эээ... для меня чужой... это... крабик, который цепляется на лицо, отмирает, из человека мини-черная хрень с зубами, которая просто выростает и откладывает яйца, в которых живут эти крабики.
Змея как-то не вклинивается в этот простой круг... в какое место змею сувать?
нене, крабик - это фейсхаггер, считай прыгучий ээ... член.
Есть матка чужих, королева. Она откладывает яйца, из которых вылупляются фейсхаггеры, которые долхны найти людей или аналогичные организмы, чтобы через горло внедрить в них зародыш. Зародыш потом вырывается из груди и вырастает в черную ящерицу с длинной башкой, собственно в Чужого. Чужой, в свою очередь, может не быть маткой, а может и быть)
Но из-за того, что зародыш, откладываемый фейсхаггером в организм, немного от этого организма берет, то мы имеем:
- черных чужих из рядовых людей
- королеву чужих из клонированной Рипли
- предалиена (чужой с хелицерами от Хищника) в случае рождения от Хищника
- белого чужого в случае рождения от Большого Белого Человека))
Змея была в Прометее. По порядку, есть линия с андроидом, который прнс вазочку из лабиринта, открыл, достал черную дрянь и напоил ею человека. Человек превратился в переломанного НЕХа, а его жена забеременела от него кальмаром.
Есть линия, что два члена экипажа отбиваются от других и заходят в галерею, где текут ручейки. Из такого ручейка вылезает "змея", человек протягивает к ней рукк со словами "привет, красавица", красавица, очевидно, обижается, бросается на человека, обматывает собой его руку, ломает, плюется кислотой и вообще всячески себя проявляет. Второй убегает, приводит подмогу и видит, что шлем первого прожжен кислотой, а змейка проникла в организм уже мертвого. Вот эта змейка - прообраз фейсхаггера, потому что у нее есть характерные "обнимательные ласты".
Когда кальмара таки извлекают из тела главгероини, она от него убегает, потом события, которые разбудили большого белого человека, которого после успешно скормили кальмару. Из белого человека потом еще рождается белесый чужой.
Потом они, видимо, по сюжету обе идеи совместились, фейсхаггер, черный чужой от гибрида с человеком, и вот это все.
Фейсхаггер... слово то какое хдд Жаль до завтра уже забуду хд
А рождение от хищника это в каком фильме?
плюется кислотой
Не, это ее там ножичком с руки хотели снять, а кровь и полилась фонтанами
которого после успешно скормили кальмару.
Его.. не кормили.. кальмар изоброзил из себя крабика и в рот ему нас.. напи... в рот ему ногу засунул.
Из белого человека потом еще рождается белесый чужой.
Это белесый?
и таки змейка это кто? это крабик какой версии, или это куда вообще?
рождение от хищника это конец ЧпХ1 и начало ЧпХ2
ну да, она плевалась в ответ на отрезанную голову)) и вот она-то и есть фейсхаггер бета-версии, предрелизный, так сказать. то, из чего потом развился крабик)
нуууу да, в какой-то мере это вот "в рот мне ноги" я и подразумевал))
оригинальные чужие совсем черные, так что да, это вроде как белесый) Но они оч похожи на оригинальных, и насколько я помню, это из них получилтсь те, которых нашла Рипли)
оригинальные чужие совсем черные,
кажется я дальтоник хддд
на-то и есть фейсхаггер бета-версии, предрелизный,
эээ... а полноценным крабиком она в какой момент стала?
Так. Стоп.
Эрик нашел сочащуюся жидкость. Будучи сукой скормил ее мужику, мужик трахнул бабу, после чего сдох. Баба заберемела осминогом, которого абортировала. Который вырос, поцеловал белого-гиганта, и из гиганты выползно "белесое".
Змея заползла в мужика и сдохла. Как змея вообще связана с вышеописаной цепочкой? Что это за сочащаяся жидкость?
ммм... скажем так, сочащаяся жидкость порождает и болезнь, случившуюся с тем, кого накормил андроид, и чужого, и крабика. Но за время между фильмами сложилось так, что змея стала крабиком ака промежуточным звеном между яйцом и внедрением в человека...
Так крабик от осминога (т.е. от чужого, который вылез из белого, который имел орал с осминогом)
крабик от сочащейся жидкости
крабик потому что змея почему-то эволюционировала в него?
крабик получился, потому что размножение через змею и кальмара было признано нерентабельным с точки зрения чужих)))
ух ты ж блин, как сложно объяснить обоснуй, в который сам не особо веришь))
Эээ.. то есть...
Так. а белесые чужуи что "откладывают"?