Логин
Чтобы агробактерия (Agrobacterium tumefaciens - агробактериум тумефациенс) передала при трансформации растения последнему целевые гены, нужно чтобы эти гены были в бактерии (Л. Логика)
Как гены попадают в бактерию?
читать дальше
Трансформация агробактерии ничем не отличается от трансформации Эшерихии коли (Escherichia coli).
А для трансформации Э.коли берется наработанный методом ПЦР целевой ген, вставляется в плазмиду, а потом плазмида - в бактерию. готово.
Вставка наработанного гена в плазмиду - очень простой процесс в наше время. Продается множество векторов (PAL2T, PTZ57), какой лучше не известно, есть очень условные критерии, но всегда лучше попробовать 1-2-3 разных. Один и тот же вектор может в одном случае сработать идеально, а в другом случае, отличающимся минимально, не сработать вообще.
У каждого продаваемого векторе есть "карта". Она выглядит так:
Красным здесь написаны сайты рестрикции - то есть то место, где тот или иной фермент (его название и написано красным), сможет разрезать "ножницами" данный вектор. Цифры рядом - это длина от "начала" плазмиды до места рестрикции.
У каждого вектора есть 2 селективных гена как минимум - устойчивости к антибиотикам чаще всего, что бы бактерия от него не избавилась. Какие именно гены в той или иной плазмиде можно узнать по их кодовым названия - в данном случае это bla (ApR) - устойчивость к ампициллину. Так же есть ген, ответственный за репликацию (удвоения) этой плазмиды - rep pMB1. Он так же обязан быть.
Вторым селективным геном является ген LacZ - он помечен синеньким на карте. Он отвечает за окраску бактерий в синий цвет (если есть необходимый компонент в среде)
Как видно, ген ЛакЗ разделен двумя зелеными участками - это "множественный сайт клонирования". Как видно, на этом участке гена ЛакЗ очень много сайтов рестриктаз. Именно между двумя зелеными участками вставляется целевой ген. И если ген вставился, то ген ЛакЗ получается разделенным, и теряет свою функцию - бактерии остаются белыми. А если встройка гена не произошла, и плазмида замкнулась сама на себе, то ген ЛакЗ работает, и бактерии окрашиваются в синий цвет.
Вот так это выглядит на чашке Петри
Процесс встройки гена в вектор называется Лигирование
Для этого банально смешивается ПЦР-фрагмент, вектор, буффер для лигирования (так же продается), АТФ, и Т4-лигаза.
И оставляется на столе на ночь.
Готово.
Трансформация бактерий полученным вектором
Клетки бактерий смешиваются со смесью после лигирования. Для контроля качества клеток, в другом эппендорфе эти же клетки - с контрольной плазмидой (например, GFP).
Оставляют во льду, после чего опускают в горячую воду (хватает и 42") на полминуты. Что бы поры бактерии открылись и она поглотила в себя плазмиды из окружения
После - снова в лед на пару минут - что бы поры резко закрылись и бактерия не успела "выплюнуть" плазмиды.
После к бактериям добавляют немного питательной среды (они обычно растут на среде LB или YEB), и оставляют на час на 37 градусов. Бактерии успеют нарасти чуть чуть, плазмиды поделится.
После чего выращивают ночь на чашке Петри.
Чашка Петри содержит агаризованную (с добавлением агара) питательную среду, так же, обязательно, антибиотик, к которому устойчива бактерия, если она содержит вектор. Чашка со средой с антибиотиком может хранится около месяца, потом антибиотик разрушается. Без антибиотика - намного дольше. Хотя иногда бывает берешь чашку, хочешь на нее что-то посадить, а она тебе такая, пошел ты:
Для того, что бы бактерия приобрела синий цвет на поверхность застывшей среды добавлюсь IPTG и X-GAL. Они не очень хороши для бактерий, поэтому важно не доабавить слишком много, и дождаться пока они высохнут. И только потом высаживать на чашку бактерии (Сажают просто переливая то, что было в эппендорфе после всех манипуляций, описанных выше)
По чашке петри вырастают колонии - т.е. сообщество клеток, прородителем которых была одна клетка. Если колоний много (На картинке выше каждая белая точка - колония), есть шанс, что какая либо точка это не одна, а две или три колонии, особенно если точки большие. Поэтому колонии пересаживают еще раз. Дно чашки петри разлиновывают (с внешней стороны), и зубочисткой пересаживают на новую чашку Петри, и оставляют рости ночь.
После это колонии наращивают в жидкой среде. Это можно делать в эппендорфах, фальконах или просто колбе.
Для проверки вставка проводят лизис.
Выращают в эппендорфах ночь. центрифуригуют, сливая все, оставляя лишь осадок в виде бактерий. Осадок ресуспензируют в лизис-буффере, который разрушает их. Для полного разрушения кипятят (в кипятке прям) минуту, и снова центрифугируют, что бы все, что осталось от бактерий упало на дно. Плазмиды, ДНК остаются в растворе. Который прогоняют на геле. ДНК и Плазмиды тоже разрушаются частично, поэтому метод годится только для ответа "да-нет", и ничего в дальнейшую работу идти не может
Для более точного анализа другим более длинным и щедящим методом выделяют днк.
После чего проводят рестрикционный анализ - к ДНК добавляют фермент, который разрезает плазмиды (и, желательно, не режет целевой ген), и наносят на гель. Зная, где должен порезать фермент, известны длины фрагмента(ов), который(ые) должен(ны) получится. Для точности повторяют с разными ферментами.
Когда в бактерию вставлено то, что нам нужно, она идет уже в дальнейшую работу.
В аграбактерии вставляют другие конструкции, но суть та же. вектор - pCambia чаще всего.
Как гены попадают в бактерию?
читать дальше
Трансформация агробактерии ничем не отличается от трансформации Эшерихии коли (Escherichia coli).
А для трансформации Э.коли берется наработанный методом ПЦР целевой ген, вставляется в плазмиду, а потом плазмида - в бактерию. готово.
Вставка наработанного гена в плазмиду - очень простой процесс в наше время. Продается множество векторов (PAL2T, PTZ57), какой лучше не известно, есть очень условные критерии, но всегда лучше попробовать 1-2-3 разных. Один и тот же вектор может в одном случае сработать идеально, а в другом случае, отличающимся минимально, не сработать вообще.
У каждого продаваемого векторе есть "карта". Она выглядит так:
Красным здесь написаны сайты рестрикции - то есть то место, где тот или иной фермент (его название и написано красным), сможет разрезать "ножницами" данный вектор. Цифры рядом - это длина от "начала" плазмиды до места рестрикции.
У каждого вектора есть 2 селективных гена как минимум - устойчивости к антибиотикам чаще всего, что бы бактерия от него не избавилась. Какие именно гены в той или иной плазмиде можно узнать по их кодовым названия - в данном случае это bla (ApR) - устойчивость к ампициллину. Так же есть ген, ответственный за репликацию (удвоения) этой плазмиды - rep pMB1. Он так же обязан быть.
Вторым селективным геном является ген LacZ - он помечен синеньким на карте. Он отвечает за окраску бактерий в синий цвет (если есть необходимый компонент в среде)
Как видно, ген ЛакЗ разделен двумя зелеными участками - это "множественный сайт клонирования". Как видно, на этом участке гена ЛакЗ очень много сайтов рестриктаз. Именно между двумя зелеными участками вставляется целевой ген. И если ген вставился, то ген ЛакЗ получается разделенным, и теряет свою функцию - бактерии остаются белыми. А если встройка гена не произошла, и плазмида замкнулась сама на себе, то ген ЛакЗ работает, и бактерии окрашиваются в синий цвет.
Вот так это выглядит на чашке Петри
Процесс встройки гена в вектор называется Лигирование
Для этого банально смешивается ПЦР-фрагмент, вектор, буффер для лигирования (так же продается), АТФ, и Т4-лигаза.
И оставляется на столе на ночь.
Готово.
Трансформация бактерий полученным вектором
Клетки бактерий смешиваются со смесью после лигирования. Для контроля качества клеток, в другом эппендорфе эти же клетки - с контрольной плазмидой (например, GFP).
Оставляют во льду, после чего опускают в горячую воду (хватает и 42") на полминуты. Что бы поры бактерии открылись и она поглотила в себя плазмиды из окружения
После - снова в лед на пару минут - что бы поры резко закрылись и бактерия не успела "выплюнуть" плазмиды.
После к бактериям добавляют немного питательной среды (они обычно растут на среде LB или YEB), и оставляют на час на 37 градусов. Бактерии успеют нарасти чуть чуть, плазмиды поделится.
После чего выращивают ночь на чашке Петри.
Чашка Петри содержит агаризованную (с добавлением агара) питательную среду, так же, обязательно, антибиотик, к которому устойчива бактерия, если она содержит вектор. Чашка со средой с антибиотиком может хранится около месяца, потом антибиотик разрушается. Без антибиотика - намного дольше. Хотя иногда бывает берешь чашку, хочешь на нее что-то посадить, а она тебе такая, пошел ты:
 | Тут на чашке вырос золотистый стафилокок. И хотя на остальной поверхности чашки ничего не видно, чашка нестерильна, среда не стерильна, и использовать ее для опытов нельзя. |
Для того, что бы бактерия приобрела синий цвет на поверхность застывшей среды добавлюсь IPTG и X-GAL. Они не очень хороши для бактерий, поэтому важно не доабавить слишком много, и дождаться пока они высохнут. И только потом высаживать на чашку бактерии (Сажают просто переливая то, что было в эппендорфе после всех манипуляций, описанных выше)
По чашке петри вырастают колонии - т.е. сообщество клеток, прородителем которых была одна клетка. Если колоний много (На картинке выше каждая белая точка - колония), есть шанс, что какая либо точка это не одна, а две или три колонии, особенно если точки большие. Поэтому колонии пересаживают еще раз. Дно чашки петри разлиновывают (с внешней стороны), и зубочисткой пересаживают на новую чашку Петри, и оставляют рости ночь.
 | Чашки хранятся с ноября, и могут хранится долго. Главное - донышком вверх, что бы влага не испарялась |
После это колонии наращивают в жидкой среде. Это можно делать в эппендорфах, фальконах или просто колбе.
 | Слева - с прозрачной средой - без бактерии. По середине с бактерией, справа - с контроль с синей бактерией |
 | Если необходимо просто проверить правильность вставки - можно выращивать в эппиндорфах, если нужно, что бы бактерии остались живы для дальнейшей работы, то нужно больше воздуха - и тогда только в фальконах или колбочках |
Для проверки вставка проводят лизис.
Выращают в эппендорфах ночь. центрифуригуют, сливая все, оставляя лишь осадок в виде бактерий. Осадок ресуспензируют в лизис-буффере, который разрушает их. Для полного разрушения кипятят (в кипятке прям) минуту, и снова центрифугируют, что бы все, что осталось от бактерий упало на дно. Плазмиды, ДНК остаются в растворе. Который прогоняют на геле. ДНК и Плазмиды тоже разрушаются частично, поэтому метод годится только для ответа "да-нет", и ничего в дальнейшую работу идти не может
 | Колония, днк которой нанесено на 4-ую дорожку имеет вставку, остальные - не того размера (слишком маленькие) |
Для более точного анализа другим более длинным и щедящим методом выделяют днк.
После чего проводят рестрикционный анализ - к ДНК добавляют фермент, который разрезает плазмиды (и, желательно, не режет целевой ген), и наносят на гель. Зная, где должен порезать фермент, известны длины фрагмента(ов), который(ые) должен(ны) получится. Для точности повторяют с разными ферментами.
Когда в бактерию вставлено то, что нам нужно, она идет уже в дальнейшую работу.
В аграбактерии вставляют другие конструкции, но суть та же. вектор - pCambia чаще всего.
@темы: Работа
-
-
06.04.2018 в 06:48последние два черно-белых снимка - как они делаются? я имею в виду, что это похоже на рентген, но вряд ли это рентген)
офигенно интересно *_* не все понятно, но меня восхищает сам факт того, что можно так делать вручную, а не случайными природными способами, и что вообще есть штуки, которые могут вклинить именно нужный ген в строго определенное место. Жаль, кстати, что фантастика про технику популярнее биологии (ну или биология идет фоном, и не рассказывают, как получился паук, который укусил Питера Паркера)))
-
-
06.04.2018 в 07:23Стандартная пластмассовая - одноразовая - 9,5 диаметр
Стандартная стеклянная - многоразовая - чуть побольше. в высоту бывают 1см, бывают 2.
Если еще маленькие - обычно пластмассовые - около 3-5см диаметр
эппендорфы на картинке - на 2мл. Это самые большие. есть еще 1,7мл, 0,5мл, и 0,1мл
Фалькон на картинке - на 15мл. Есть еще на 50 и на 5.
черно-белых снимка - как они делаются?
ДНК/РНК прогоняют на агарозном геле. В сам гель, пока тот не застыл, добавляют бромистый итидий. Можно гель положить после электрофореза в раствор с бромистым итидием.
Бромистый итидий легко связывается с ДНК/РНК. А после он светится в ультрафиолете. Два последний снимка просто сняты на черно-белый фотоаппарат + выкрученный контраст на первом, что бы полоски хоть немного были видны (зернистость потому что у меня только тапок есть).
Вообще гель после электрофореза выглядит так (лежит на УФ-лампе):
не все понятно
Так спрашивай))))
фантастика про технику популярнее биологии
Ну... обе фантастики говорят примерно так: "он это сделал и все". Нигде не обьясняется, как именно холодный термояд сделать, как именно получили искуственную гравитацию, как паук сделал паркера пауков.
Просто "проверить" все биологические фантистики можно. Скольких людей укусили пауки? Сколько людей пережили радиационную вспышку? А сколько из них стали Паркерами или песочными человеками ит.д.? Поэтому это "сказки". А "техническая" фантастика - это мечты, к которым надо стремится. х(((
-
-
06.04.2018 в 08:26а центрифугирование - это такое аккуратное побалтывание платформой за стеклянной дверцей, или таки вращение на большой скорости как при отжиме фруктов?
думаю, никакому автору не хватит знаний описать свои фантастические обоснуи) а тому, кому хватит, интереснее в лаборатории, а не на писательском поприще)
-
-
06.04.2018 в 08:37центрифугирование - это всегда на большой скорости в центрифуге. ^^ у слова я не знаю других значений
побалтывание на платформе - это качалка, перемешивание)))
Ну когда снимаются фильмы периодически же всплывают фразы "мы советывались реально ли это с учеными" ит.д. Как там было..
во время съёмок фильма "Стражи Галактики" Marvel специально консультировалась с NASA по поводу того, реальна ли сцена со спасением Гаморы Стар Лордом из вакуума. И их ответ был — да, такое вполне возможно.
У меня другой вопрос: зачем консультироваться с учеными по поводу реализма в фильме, в котором говорящий Енот стреляет из пулемета, сидя на плече у гигантского разумного дерева?
-
-
06.04.2018 в 08:59а зачем перемешивать на платформе, а не просто в емкости?)
Если честно, терпеть не могу сцены спасения из вакуума) особенно когда герой оттуда возвращается без последствий. Лею хоть для приличия в последнем фильме подержали в медблоке...
Видимо, исходя из того, что енота и дерево таки можно вывести/найти на другой планете, а тут - фииииизика... *а взрывающиеся штуки в космосе до сих пор умеют бахать, а то не зрелищно)
-
-
06.04.2018 в 09:07бактерию (клетки, корни, калусс, что-то еще, чему надо перемешивать) - в емкость (колба, иппендорф, фалькон). Емкость - на платформу, которая качается сама и качает этим колбу, перемешивая в колбе среду. х)
9 кругов бактериального ада.
О-ё-ёй, какой я плохой, плохая лама хдддд
ну пффф, не знаю. Должны быть они, не должны они быть... Звук не должен распространяться, да, а должны ли быть последствия от кратковременного пребывания инопланетянина (!) в космосе...
-
-
06.04.2018 в 09:29а должны ли быть последствия от кратковременного пребывания инопланетянина (!) в космосе...
ну оно как минимум теплокровное, содержит прилично воды в себе и вообще... а она инопланетянка? Мне казалось, она просто зеленокожая. Ну, как негры, только зеленокожая)
-
-
06.04.2018 в 09:34Ммм... Я уже в нем.
Это как в анекдоте:
В параллельной вселенной не люди грабят банки, а банки людей. А.. нет.. это в этой..
Ну веточка вербы тоже содержит много воды, но можно бросить и в космос, и в морозилку, и ей будет норма. А уж если брать семена растений... хддд
Она не с земли. Она с уничтоженной планеты... Кто ее знает какие у нее там механизмы в организме? Пока не сказано, что она от человека отличается только цветом кожи, то она может отличаться чем угодно...
-
-
06.04.2018 в 09:38хммм, аргумент)) тогда продолжу докапываться до бахающих взрывов
-
-
06.04.2018 в 09:43Ммм.. ну, взрывы то бабахают, насколько я понимаю. Вокруг места взрыва молекулы-то есть для колебания. Просто звук не распространяется. И его никто с корабля услышать не будет. Но "зритель" то неизвестно где.
Меня больше смущают взрывы в ЗВ, не помню в каких по номеру... кажется в 3их... когда звук сначала пропадал, а потом был взрыв.
А вот что, кажися, не возможно никак, нигде - это стрелялки лазерами х)
-
-
06.04.2018 в 09:50а жаль, пиу-пиу миленькое) хотя если это не конкретно лазер, а какие-то энергетические заряды...
-
-
06.04.2018 в 10:00Ну да, стрелять надо тем, что не рассеивается. Пистолетом можно х) Пулетом Максим....
-
-
06.04.2018 в 10:07Е-мое, пушки с ядрами с космосе) тленота)))
-
-
06.04.2018 в 10:11О! Я знаю, что мне посмотреть хддд
Ну круто-не круто, но тут с телефоном периодически воюешь, а тут КОРАБЛЬ!
Мне кажется серсорное управлением можно, если на корабле есть что-то типо Джарвиса или суки-Дэвида...
-На нас напали повстанцы, у них Максимы!!
-Поднять Т-34 на верх.
-
-
06.04.2018 в 10:21лучший искин корабля - в игре No man's sky": всегда приветствует пилота, предупреждает о состоянии корабля и ресурсов и обладает чудным голосом.
А Джарвис и Дэвид - ненене, нафиг таких андроидов)))
хм, зато можно поставить на корабль
свечной заводикконвейер, где руда будет перерабатываться в патроны, а отходы - в топку. А руды много в болтающемся по космосу мусоре... Хм, так вот откуда в играх это "нужно 14 литий")))-
-
06.04.2018 в 10:26А я и звездный десант не смотрел...
Я вообще мало по космосу смотрел, только что-то очень популярное..
Дэвид-то понятно почему нафиг.
Потому что он не УолтерА Джарвис-то чем плох? Он тоже предупреждает обо всем. И голос ничего так, мне нравитсяАх.. Пол... делайся уже быстрее, сука хдддХм, так вот откуда в играх это "нужно 14 литий"
Осталось понять зачем дерево))) И откуда...
я не знаю в какую игру я играл, там город строился переселенцев-
-
06.04.2018 в 10:34Джарвис нарушил первый закон робототехники еще в первом Чужом)))
Дерево нужно для отделки перил, поэтому в тех вселенных, где дерево труднодобываемо, перил нет (привет, звездные войны )))
-
-
06.04.2018 в 10:43Окей... пойду смотреть короче игру)
Эмм... джаврис я имел ввиду не ходячего андроид типо Дэвида или того вот... Эша (кажется), а именно джарвиса, "голос", "умным дом",.. ну джарвис, голос.. ну... ну блин)))
где дерево труднодобываемо, перил нет
А.. а.. а из камня? А железные?
-
-
06.04.2018 в 10:48а, тьху, Джарвис это ж помощник Тони Старка, сорри, фэндомы попутал) Да, Джарвис хорош))
ненен, только дерево - или ходить по тонким мостикам над реакторами просто так)
-
-
06.04.2018 в 10:58Андроида-суку в 1-ом чужом звали Эш, кажется... систему корабля мама, да... а в прометее андроида-суку звали Дэвид х) а не суку в Завете Уолтер х)
Да, Джарвис хороший)) И голос хороший) Пол Беттани же, милашке же...
тема на миними которого еще с 15 года... почему-то никто не хочет Пола себеПланировка здания никудышная (с) Ох.. что же все тут такое.. высокое (с)
Ну хоть мостики не круглые аля-трубы х)
-
-
06.04.2018 в 11:08Беттани мне больше нравился в Пастыре, ммм))
мостик - подиум между двух колодцев, ппц безопасность)
-
-
06.04.2018 в 11:18плавно перешли с вашей территории на мою хдддПол Беттани изначально, еще с ЖЧ-1 озвучивал Джарвиса.
То ли правда, то ли нет, но ходит история, что Полу дали деньги, попросили начитать текст, он это сделал за полдня и пошел на свидание с женой, и только когда уже пришел на фильм ЖЧ просто в кино, узнал, для какого фильма он наговаривал все эти фразы.
По сюжету фильм создавая нового альтрона Тони засунул туда операционку Джарвиса, поэтому Вижн, грубо говоря, усовершеноствованный Джарвис. Поэтому его и играет тот, кто озвучивал Джарвиса))
Мне вот как Тор пришел, я из него уже 4-ий раз делаю Тора. Мне кажется сейчас таки мы добьем коллективки, мне придет Пол, и я буду делать Джарвиса, Пастыря, Пыльнорука,...
А, а то есть в играх моменты, когда, как раз как в Я,робот: огромный колодец, в центре него парит островок, и на островок надо. А к нему ведет мост, больше напоминающий трубу. Больше всего по прохождению по этому "мосту" меня радовало, что с него почему-то не то что он не соскальзывает, а даже специально нельзя спрыгнуть хддд
-
-
06.04.2018 в 11:41может, труба была аэродинамической, и их тупо задувает на место?)
-
-
06.04.2018 в 11:47Ну с него даже когда Джарвиса рисовали человеком (в основном для пейринга Джарвис-Тони), рисовали блондином
Артики
Все с этой фотки началось
и их тупо задувает на место?)
А одежда нажелатинена, что бы не двигаться от ветра. Может быть, может быть)))
-
-
06.04.2018 в 11:53-
-
06.04.2018 в 11:54ну теперь тем более мне не-синий Джарвис нравится еще больше. Он тогда еще не готовил паприкаш для Красной Ведьмы)
-
-
06.04.2018 в 11:55а можно еще лампочку со лба убрать?)
-
-
06.04.2018 в 12:01Эмм.. Он... пурпурнеый... красненький... О_О
а можно еще лампочку со лба убрать?)
-
-
06.04.2018 в 12:06я почему-то помнил его голубоватым полупрозрачным О_о
а кто был синий? или он был из DC? наверное, оттуда.
о, спасиб, Танос)
-
-
06.04.2018 в 12:18Синий... Сииииний... Сиииинииииий.... Хммм....
В марвел из этой же киновселеной Небула синяя
о, спасиб, Танос)
Правда Джарвис скорее всего кирдык если "лампочку" выглючить... Так что наверно не вытащат.
Мне нравится арт про Тони и его лампочку: