Как гены попадают в бактерию?
читать дальше
Трансформация агробактерии ничем не отличается от трансформации Эшерихии коли (Escherichia coli).
А для трансформации Э.коли берется наработанный методом ПЦР целевой ген, вставляется в плазмиду, а потом плазмида - в бактерию. готово.
Вставка наработанного гена в плазмиду - очень простой процесс в наше время. Продается множество векторов (PAL2T, PTZ57), какой лучше не известно, есть очень условные критерии, но всегда лучше попробовать 1-2-3 разных. Один и тот же вектор может в одном случае сработать идеально, а в другом случае, отличающимся минимально, не сработать вообще.
У каждого продаваемого векторе есть "карта". Она выглядит так:
Красным здесь написаны сайты рестрикции - то есть то место, где тот или иной фермент (его название и написано красным), сможет разрезать "ножницами" данный вектор. Цифры рядом - это длина от "начала" плазмиды до места рестрикции.
У каждого вектора есть 2 селективных гена как минимум - устойчивости к антибиотикам чаще всего, что бы бактерия от него не избавилась. Какие именно гены в той или иной плазмиде можно узнать по их кодовым названия - в данном случае это bla (ApR) - устойчивость к ампициллину. Так же есть ген, ответственный за репликацию (удвоения) этой плазмиды - rep pMB1. Он так же обязан быть.
Вторым селективным геном является ген LacZ - он помечен синеньким на карте. Он отвечает за окраску бактерий в синий цвет (если есть необходимый компонент в среде)
Как видно, ген ЛакЗ разделен двумя зелеными участками - это "множественный сайт клонирования". Как видно, на этом участке гена ЛакЗ очень много сайтов рестриктаз. Именно между двумя зелеными участками вставляется целевой ген. И если ген вставился, то ген ЛакЗ получается разделенным, и теряет свою функцию - бактерии остаются белыми. А если встройка гена не произошла, и плазмида замкнулась сама на себе, то ген ЛакЗ работает, и бактерии окрашиваются в синий цвет.
Вот так это выглядит на чашке Петри
Процесс встройки гена в вектор называется Лигирование
Для этого банально смешивается ПЦР-фрагмент, вектор, буффер для лигирования (так же продается), АТФ, и Т4-лигаза.
И оставляется на столе на ночь.
Готово.
Трансформация бактерий полученным вектором
Клетки бактерий смешиваются со смесью после лигирования. Для контроля качества клеток, в другом эппендорфе эти же клетки - с контрольной плазмидой (например, GFP).
Оставляют во льду, после чего опускают в горячую воду (хватает и 42") на полминуты. Что бы поры бактерии открылись и она поглотила в себя плазмиды из окружения
После - снова в лед на пару минут - что бы поры резко закрылись и бактерия не успела "выплюнуть" плазмиды.
После к бактериям добавляют немного питательной среды (они обычно растут на среде LB или YEB), и оставляют на час на 37 градусов. Бактерии успеют нарасти чуть чуть, плазмиды поделится.
После чего выращивают ночь на чашке Петри.
Чашка Петри содержит агаризованную (с добавлением агара) питательную среду, так же, обязательно, антибиотик, к которому устойчива бактерия, если она содержит вектор. Чашка со средой с антибиотиком может хранится около месяца, потом антибиотик разрушается. Без антибиотика - намного дольше. Хотя иногда бывает берешь чашку, хочешь на нее что-то посадить, а она тебе такая, пошел ты:
| Тут на чашке вырос золотистый стафилокок. И хотя на остальной поверхности чашки ничего не видно, чашка нестерильна, среда не стерильна, и использовать ее для опытов нельзя. |
Для того, что бы бактерия приобрела синий цвет на поверхность застывшей среды добавлюсь IPTG и X-GAL. Они не очень хороши для бактерий, поэтому важно не доабавить слишком много, и дождаться пока они высохнут. И только потом высаживать на чашку бактерии (Сажают просто переливая то, что было в эппендорфе после всех манипуляций, описанных выше)
По чашке петри вырастают колонии - т.е. сообщество клеток, прородителем которых была одна клетка. Если колоний много (На картинке выше каждая белая точка - колония), есть шанс, что какая либо точка это не одна, а две или три колонии, особенно если точки большие. Поэтому колонии пересаживают еще раз. Дно чашки петри разлиновывают (с внешней стороны), и зубочисткой пересаживают на новую чашку Петри, и оставляют рости ночь.
| Чашки хранятся с ноября, и могут хранится долго. Главное - донышком вверх, что бы влага не испарялась |
После это колонии наращивают в жидкой среде. Это можно делать в эппендорфах, фальконах или просто колбе.
| Слева - с прозрачной средой - без бактерии. По середине с бактерией, справа - с контроль с синей бактерией |
| Если необходимо просто проверить правильность вставки - можно выращивать в эппиндорфах, если нужно, что бы бактерии остались живы для дальнейшей работы, то нужно больше воздуха - и тогда только в фальконах или колбочках |
Для проверки вставка проводят лизис.
Выращают в эппендорфах ночь. центрифуригуют, сливая все, оставляя лишь осадок в виде бактерий. Осадок ресуспензируют в лизис-буффере, который разрушает их. Для полного разрушения кипятят (в кипятке прям) минуту, и снова центрифугируют, что бы все, что осталось от бактерий упало на дно. Плазмиды, ДНК остаются в растворе. Который прогоняют на геле. ДНК и Плазмиды тоже разрушаются частично, поэтому метод годится только для ответа "да-нет", и ничего в дальнейшую работу идти не может
| Колония, днк которой нанесено на 4-ую дорожку имеет вставку, остальные - не того размера (слишком маленькие) |
Для более точного анализа другим более длинным и щедящим методом выделяют днк.
После чего проводят рестрикционный анализ - к ДНК добавляют фермент, который разрезает плазмиды (и, желательно, не режет целевой ген), и наносят на гель. Зная, где должен порезать фермент, известны длины фрагмента(ов), который(ые) должен(ны) получится. Для точности повторяют с разными ферментами.
Когда в бактерию вставлено то, что нам нужно, она идет уже в дальнейшую работу.
В аграбактерии вставляют другие конструкции, но суть та же. вектор - pCambia чаще всего.